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Contrôle de la filamentation de Yarrowia lipolytica par la maîtrise de la conduite de fermentation

La levure Yarrowia lipolytica suscite un intérêt grandissant de part de sa capacité à utiliser des sources de carbone diverses et à produire un large spectre de métabolites d’intérêt (lipides, protéines, acides organiques, arômes). Cependant, en réponse aux fluctuations de son environnement, Y. lipolytica met en place des transitions métaboliques et dimorphiques qui peuvent conduire à des difficultés de mise en œuvre des bioprocédés. Nos travaux précédents (projet ANR-PIA Probio3) ont montré que la réponse de Y. lipolytica à des conditions de stress (pH, oxygène dissous) était dépendante du mode de culture et ont permis d’émettre l’hypothèse d’une relation entre la concentration en sucre résiduel (i. e. excès pour le mode discontinu et limitant pour le mode continu) et l’induction de la filamentation en présence de stress. Par une approche couplant le génie microbiologique, la microfluidique et l’analyse à l’échelle de la cellule unique, nous avons pu démontrer le lien entre la concentration en sucre résiduel, l’AMPc et la filamentation. Des études transcriptomiques devraient nous permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation mis en jeu. Néanmoins, le contrôle de la filamentation par la maîtrise de la conduite du bioprocédé est un résultat-clé pour le développement de procédés biotechnologiques avec la levure Y. lipolytica.

La levure Yarrowia lipolytica suscite un intérêt grandissant pour des applications en biotechnologie industrielle de part sa capacité à utiliser des sources de carbone diverses et à produire un large spectre de métabolites d’intérêt. Cependant, en réponse aux fluctuations environnementales, Y. lipolytica subit des transitions dimorphiques amenant des difficultés de mise en œuvre des bioprocédés (perte de rendement, limitation des transferts, impact sur la rhéologie des milieux).

Dans nos travaux précédents réalisés dans le cadre du projet Probio3 (ANR-PIA), il a été démontré qu’en culture discontinue (excès de sucre), Y. lipolytica filamente en réponse à des fluctuations de pH ou d’oxygène dissous. En revanche, elle conserve sa forme ovoïde en culture continue (sucre résiduel nul) sous des conditions identiques de stress. Ainsi la morphologie de la levure peut être controlée par la conduite du procédé. Jusqu’à présentle déclenchement de la filamentation était décrit comme induit par des conditions de stress et dépendant de la souche mise en œuvre. L’hypothèse soulevée par nos travaux était l’existence d’une relation entre la concentration en sucre résiduel dans la culture, et l’induction de la filamentation en présence de stress.

Des cultures de Y. lipolytica en mode accélerostat ont été réalisées en condition de stress. Le mode accélérostat permet d’augmenter progressivement la vitesse de croissance cellulaire , qui s’accompagne d’une augmentation progressive de la concentration en glucose résiduel. Les résultats obtenus ont mis clairement en évidence que Y. lipolytica conservait une morphologie ovoïde lorsque la concentration résiduelle de glucose restait inférieure à une valeur seuil d’environ 0,35mg L-1. Une transition vers des formes plus allongées se déclenchent à ce seuil, et s’intensifient progressivement avec l’augmentation de la concentration en sucre résiduel.  Grâce à la mise en œuvre d’un microréacteur instrumenté, il nous a été possible d’explorer le mécanisme de régulation de la transition dimorphique en lien avec la concentration en sucre résiduel et la concentration en AMPc impliquée dans les cascades de réponse au stress chez les levures. L’effet de l’AMPc sur la transition a été évalué par l’ajout d’AMPc et la quantification de ses niveaux intracellulaires au cours d’un accélérostat. Nous avons confirmé que l’ajout exogène d’AMPc inhibait la morphologie mycélienne de Y. lipolytica, même avec des concentrations de glucose dépassant le niveau seuil de 0,35mg.L-1. Tous ces résultats suggèrent que les réponses dimorphiques chez Y. lipolytica sont régulées par les voies de signalisation du sucre, très probablement via la voie dépendante de l’AMPc-PKA, pour lequel l’AMPc a été décrit comme activateur.

Des études transcriptomiques en cours de traitement devraient nous permettre de mieux comprendre les mécanismes de régulation mis en en jeu.

Valorisation :

D’ores et déjà la possibilité de contrôler la filamentation par la maîtrise de la conduite du bioprocédé est un résultat clé pour le développement de procédés biotechnologiques avec la levure Y. lipolytica.

 

Références bibliographiques :

  1. Lesage J, Timoumi A, Cenard S, Lombard E, Lee HLT, Guillouet SE, Gorret N (2021). Accelerostat study in conventional and microfluidic bioreactors to assess the key role of residual glucose in the dimorphic transition of Yarrowia lipolytica in response to environmental stimuli. New Biotechnology 64:37-45 doi:https://doi.org/10.1016/j.nbt.2021.05.004
  1. Timoumi A, Guillouet SE, Molina-Jouve C, Fillaudeau L, Gorret N. (2018). Impacts of environmental conditions on product formation and morphology of Yarrowia lipolytica. Appl Microbiol Biotechnol 102:3831-3848. doi: 10.1007/s00253-018-8870-3
  1. Timoumi A, Bideaux C, Guillouet SE, Allouche Y, Molina-Jouve C, Fillaudeau L, Gorret N. (2017). Influence of oxygen availability on the metabolism and morphology of Yarrowia lipolytica: insights into the impact of glucose levels on dimorphism. Appl Microbiol Biotechnol 101:7317-7333.
  1. Timoumi A, Cléret M, Bideaux C, Guillouet SE, Allouche Y, Molina-Jouve C, Fillaudeau L, Gorret N (2016). Dynamic behavior of Yarrowia lipolytica in response to pH perturbations: dependence of the stress response on the culture mode. Applied Microbiology and Biotechnology:1-16 doi:10.1007/s00253-016-7856-2

 

Contact : ngorret@insa-toulouse.fr (Nathalie Gorret – TBI-FAME group)

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