Thèse : Characterization and Engineering of Oligosaccharide Transporters
Composition du jury proposé
Mme Gabrielle POTOCKI-VERONESE INRAE Occitanie-Toulouse Directrice de thèse Mme Aurore LABOUREL INRAE Occitanie-Toulouse Co-directrice de thèse M. François THOMAS CNRS Bretagne et Pays de la Loire Examinateur Mme Isabelle MEYNIAL-SALLES INSA Toulouse Examinatrice M. Roland MARMEISSE CNRS Paris-Centre Rapporteur M. Henri-Pierre FIEROBE CNRS Côte d’Azur Rapporteur
| Mots-clés : | Transporteurs,Oligosaccharides,Ingénierie des protéines,SusC/D,Relations structure-Fonction,Enzymes actives sur les sucres |
Résumé :Les mammifères hébergent des communautés microbiennes très diverses. Parmi celles-ci, le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la santé de l’hôte. Les bactéries intestinales utilisent des polysaccharides et oligosaccharides variés comme principales sources de carbone, en utilisant des systèmes protéiques complexes pour dégrader ces substrats en monosaccharides assimilables. Les bactéries du phylum Bacteroidota sont parmi les plus abondantes dans les microbiomes intestinaux des mammifères. Elles produisent une série de protéines nécessaires à la détection, à la capture, au transport et à la dégradation des polysaccharides et oligosaccharides. Ces systèmes complexes sont codés par des loci dédiés à l’utilisation des polysaccharides (PUL). A la surface cellulaire, les protéines de liaison aux glycanes (SGBPs) jouent un rôle majeur dans l’efficacité de capture des polysaccharides et des oligosaccharides entourant les cellules, offrant ainsi aux Bacteroidota un avantage compétitif dans la colonisation de leurs habitats. . Dans ce travail de thèse, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation et l’ingénierie des transporteurs de bactéries du phylum Bacteroidota, en particulier leurs composants SGBPs, isses des microbiomes digestifs humains et bovins. L’objectif était d’élucider les relations structure-fonction des différents éléments protéiques de ces transporteurs impliqués dans l’utilisation des polysaccharides d’origine alimentaire ou microbiennne. Nous avons tout d’abord caractérisé la fonction et la structure cristallographique d’une protéine de type SusD (appelée ici F5_SusD-like) codée par un PUL provenant d’un Bacteroides non cultivé de l’intestin humain, et qui est conservé chez Bacteroides vulgatus, une espèce dominante dans le microbiote intestinal. Malgré son incapacité à se lier aux xylooligosaccharides (XOS), qui sont pourtant les substrats ciblés par le F5_PUL, F5_SusD est essentiel à la fonctionnalité du transport. L’analyse structurale a révélé des boucles désordonnées et des résidus clés mal alignés, qui pourraient être responsables de l’incapacité de cette protéine de type SGBP à se lier aux XOS. Dans un second temps, nous avons étudié la spécificité des transporteurs F5_SusC/D et F5_MFS vis-à-vis des XOS en introduisant une β-mannosidase dans le périplasme des souches recombinantes d’E. coli produisant ces transporteurs. En utilisant des variants du locus F5 précédemment construits par Tauzin et al., nous avons complété le système d’utilisation des oligosaccharides de F5 avec l’enzyme BT_0458 de la famille CAZy GH2. Nos données préliminaires suggèrent que les transporteurs du clone métagénomique F5 ne peuvent pas internaliser le mannotriose, indiquant une probable stricte spécificité de ces systèmes vis-à-vis des XOS. Par la suite, nous avons exploré le potentiel de l’évolution adaptative en laboratoire (ALE) pour l’ingénierie du système recombinant d’utilisation des XOS chez E. coli. Cette étude préliminaire indique que l’évolution in cellulo pourrait servir à améliorer les fonctions de transporteurs recombinants chez E. coli et à approfondir l’étude de leurs relations structure-fonction sous pression évolutive. Enfin, nous avons caractérisé une autre protéine de type SusD (appelée 41O1_SusD) codée par un locus d’utilisation de β-glucanes et provenant d’un clone métagénomique isolé du microbiome du rumen bovin. La caractérisation fonctionnelle de cette protéine a montré que 41O1_SusD présente une affinité de liaison pour les β-1,3-glucanes ramifiés par des liaisons β-1,6. Une comparaison structurale avec des protéines homologues a permis de mettre en évidence des motifs similaires de reconnaissance du substrat, impliquant trois résidus tryptophane. Ces résultats ont permis de progresser dans la compréhension du rôle joué par les protéines de type SusD dans l’utilisation des substrats issus de la paroi cellulaire végétale et/ou d’origine fongique dans le rumen bovin.
